Tous ceux qui ont commandé des peptides ont parfois trouvé avec elles des certificats d'analyses avec de jolies graphiques mais qui a essayé de les comprendre et de vérifier leur sérieux par rapport à la pureté annoncée
L'importance de la pureté d'un peptide est très importante car cela détermine son utilisation
1- Immunograde peptide (pureté >75%): le peptide est précipité et lavé plusieurs fois pour une extraction complète des impuretés organiques et pour éliminer le maximum de produits secondaires. Ce niveau de pureté est généralement suffisant pour produire ou tester des anticorps.
2- Peptides purifiés (pureté >85%): permet l'élimination des peptides résultant de réactions de couplage incomplètes, peptides pour lesquels il manque un ou plusieurs acides aminés. Les degrés > à 85 % peuvent être utilisés pour la production d'antisérum, la titration d'anticorps par ELISA et pour la production d'anticorps monoclonaux.
3- Peptides hautement purifiés (pureté >95%): ce degré de pureté est nécessaire pour la plupart des études biologiques ou enzymatiques.
Chez labpe j'ai eu
Chromatogramme HPLC :
La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), mais on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les années 1990 est une technique de séparation analytique en fonction de l'hydrophobicité et la préparation des molécules d'un composé ou d'un mélange de composés. Pour faire simple il s'agit d'un procédé dans lequel un mélange de composés est étudié analysé et décomposé pour voir de combien composants différent il est constitué. Le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres.
Cette méthode n'identifie pas de composé spécifique mais tous ceux qui sont présent
Il ne vous donne pas la masse du composé ( en dalton ) que vous chercher c'est à vous de faire un chasse croise de ce que vous cherche.
Vous avez juste la preuve que vous avez quelque chose dans votre flacon, il va vous le montrer mais c'est tout. Mais il n'indique pas le degré de pureté, ni s'il y a plusieurs composants étranger indésirable à votre produit.
Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le chromatogramme.
Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes :
Il existe différent type de HPLC ( allez deviner la quelle est utilise )
Je vais juste à m'intéresse à une d'entre elles qui me paraît un peu plus fiable ( mais je peux me tromper )
La chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de filtration sur gel
En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères. Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie ( la géométrie : pour une même masse molaire ), une protéine "allongée" n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire. L'altération de la forme de la protéine modifiera le résultat.
Source :
http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_liquide_%C3%A0_haute_performance
http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/Physique/chim/jumber/HPLC/Chromatographie_en_phase_liquide.htm
http://www.waters.com/waters/fr_FR/HPLC---High-Performance-Liquid-Chromatography/nav.htm?cid=10048919&locale=fr_FR
http://www.doping.chuv.ch/files/presentation-lc-fr.pdf
La spectrométrie de masse ou MS:
La spectrométrie de masse (en anglais, mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
Il n'est vraiment pas beaucoup plus précis que cela. Il est essentiellement utilisé pour déterminer la composition élémentaire d'un échantillon sur la base du poids des molécules. L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires.On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire »). La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic moléculaire ».De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant.
Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Mais cela ne vous dira pas que vous avez un échantillon pur , ni qu'elle est le poids de la masse réelle de l'échantillon et s'il y a d'autres molécules avec un autre poids dans votre échantillon. Encore une fois ( j'insiste ) elle ne sera pas vous dire quel est le poids total de l'échantillon (comme le poids total du produit). Ce que je veux dire, c'est que si je tourne avec un flacon de GHR-6 et si le vendeur fait un spectromètre de masse et il revient avec un pic parfait à 873 daltons. Tout ce que sa veut dire, c'est qu'il y avait du GHR-6 dans l’échantillon Il me dira pas quelle quantité de GHR-6 il y a dans cet échantillon ni son degré de pureté ou impureté ( c'est au choix )
La spectrométrie de masse permet de réaliser un séquençage direct des peptides même lorsque l'extrémité terminale du peptide est bloquée et même si le peptide n'est pas pur.
Le premier étage sélectionne un ion correspondant au peptide considéré, et le second étage permet de suivre sa fragmentation. Celle-ci se réalise par coupure au niveau des liaisons peptidiques principalement (et ce à partir des deux extrémités). Il est alors possible de déduire de l'ensemble des ions obtenus la séquence peptidique lue simultanément dans les deux sens.
Cette méthode est surtout utilisée pour l'analyse des petites molécules. Selon leur volatilité et leur fragilité, on est amené à utiliser des méthodes d'ionisation différentes. La MS permet donc de déterminer le poids moléculaire d'une substance, et les diverses fragmentations renseignent sur sa structure.
Mais on a toujours rien sur la pureté, il faudrait utiliser d'autre techniques complémentaires. Pour preuve la MS fournit des éléments d'information sur la structure des oligosaccharides fixés sur les chaînes peptidiques. Il existe des méthodes chimiques simples de déglycosylation des protéines N- ou O-glycosylées, qui laissent intacts les résidus oligosaccharides. La MS permet d'obtenir la masse moléculaire des oligosaccharides, et l'analyse des fragmentations renseigne sur la nature des sucres présents. Il est toutefois nécessaire d'utiliser simultanément d'autres techniques complémentaires (clivages enzymatiques, RMN,…).
Source
http://www.cnrs.fr/Cnrspresse/n386/pdf/n386a01.pdf
https://cours.espci.fr/site.php?id=41&fileid=230
http://www-esbs.u-strasbg.fr/notesdecours/3eme-annee/gap/MmeSanglier05-10-05/Intro_SS.pdf
http://biologie.univ-mrs.fr/upload/p289/SpectroMasse_300413.pdf
Le couplage HPLC à un spectromètre de masse
Lorsque le détecteur montre un pic, une partie de ce qui se passe à travers le détecteur à ce moment peut être redirigés vers un spectromètre de masse. Là, il donnera un schéma de fragmentation, qui peut être comparée à une base de données de modèles connus. Cela signifie que l'identité d'une vaste gamme de composés peut être trouvée sans avoir à connaître leur temps de rétention.
L'importance de la pureté d'un peptide est très importante car cela détermine son utilisation
1- Immunograde peptide (pureté >75%): le peptide est précipité et lavé plusieurs fois pour une extraction complète des impuretés organiques et pour éliminer le maximum de produits secondaires. Ce niveau de pureté est généralement suffisant pour produire ou tester des anticorps.
2- Peptides purifiés (pureté >85%): permet l'élimination des peptides résultant de réactions de couplage incomplètes, peptides pour lesquels il manque un ou plusieurs acides aminés. Les degrés > à 85 % peuvent être utilisés pour la production d'antisérum, la titration d'anticorps par ELISA et pour la production d'anticorps monoclonaux.
3- Peptides hautement purifiés (pureté >95%): ce degré de pureté est nécessaire pour la plupart des études biologiques ou enzymatiques.
Chez labpe j'ai eu
Chromatogramme HPLC :
La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), mais on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les années 1990 est une technique de séparation analytique en fonction de l'hydrophobicité et la préparation des molécules d'un composé ou d'un mélange de composés. Pour faire simple il s'agit d'un procédé dans lequel un mélange de composés est étudié analysé et décomposé pour voir de combien composants différent il est constitué. Le flux du fluide vecteur étant continu, c'est la rétention plus ou moins longue des différentes molécules sur le support fixe, qui va les séparer les unes des autres.
Cette méthode n'identifie pas de composé spécifique mais tous ceux qui sont présent
Il ne vous donne pas la masse du composé ( en dalton ) que vous chercher c'est à vous de faire un chasse croise de ce que vous cherche.
Vous avez juste la preuve que vous avez quelque chose dans votre flacon, il va vous le montrer mais c'est tout. Mais il n'indique pas le degré de pureté, ni s'il y a plusieurs composants étranger indésirable à votre produit.
Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le chromatogramme.
Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caractéristiques différentes :
- le temps de rétention ou tR, temps du maximum du pic. On appelle t0 ou temps de rétention nulle le temps correspondant à un composé non retenu chromatographiquement. Donc il ne donne pas le poids de la molécule et on ne peux pas l'identifier à partir de sa masse molaire
- la largeur du pic, mesurée à mi-hauteur : ω1/2, ou à sa base, par l'intersection des tangentes du pic à ses points d'inflexion avec la ligne de base : ω. Cela nous donne la concentration mais il identifie pas la molécule
- Alors, quand vous voyez un certificat d'analyse d'un produit soi-disant pur par HPLC vous devez être méfiant.
Il existe différent type de HPLC ( allez deviner la quelle est utilise )
Je vais juste à m'intéresse à une d'entre elles qui me paraît un peu plus fiable ( mais je peux me tromper )
La chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer. Un mélange de molécules que l'on appelle standards, de masses molaires connues, est séparé par chromatographie de filtration sur gel
En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères. Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie ( la géométrie : pour une même masse molaire ), une protéine "allongée" n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire. L'altération de la forme de la protéine modifiera le résultat.
Source :
http://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_liquide_%C3%A0_haute_performance
http://www.ac-nancy-metz.fr/enseign/Physique/chim/jumber/HPLC/Chromatographie_en_phase_liquide.htm
http://www.waters.com/waters/fr_FR/HPLC---High-Performance-Liquid-Chromatography/nav.htm?cid=10048919&locale=fr_FR
http://www.doping.chuv.ch/files/presentation-lc-fr.pdf
La spectrométrie de masse ou MS:
La spectrométrie de masse (en anglais, mass spectrometry ou MS) est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure chimique. Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z).
Il n'est vraiment pas beaucoup plus précis que cela. Il est essentiellement utilisé pour déterminer la composition élémentaire d'un échantillon sur la base du poids des molécules. L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires.On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire »). La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic moléculaire ».De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant.
Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Mais cela ne vous dira pas que vous avez un échantillon pur , ni qu'elle est le poids de la masse réelle de l'échantillon et s'il y a d'autres molécules avec un autre poids dans votre échantillon. Encore une fois ( j'insiste ) elle ne sera pas vous dire quel est le poids total de l'échantillon (comme le poids total du produit). Ce que je veux dire, c'est que si je tourne avec un flacon de GHR-6 et si le vendeur fait un spectromètre de masse et il revient avec un pic parfait à 873 daltons. Tout ce que sa veut dire, c'est qu'il y avait du GHR-6 dans l’échantillon Il me dira pas quelle quantité de GHR-6 il y a dans cet échantillon ni son degré de pureté ou impureté ( c'est au choix )
La spectrométrie de masse permet de réaliser un séquençage direct des peptides même lorsque l'extrémité terminale du peptide est bloquée et même si le peptide n'est pas pur.
Le premier étage sélectionne un ion correspondant au peptide considéré, et le second étage permet de suivre sa fragmentation. Celle-ci se réalise par coupure au niveau des liaisons peptidiques principalement (et ce à partir des deux extrémités). Il est alors possible de déduire de l'ensemble des ions obtenus la séquence peptidique lue simultanément dans les deux sens.
Cette méthode est surtout utilisée pour l'analyse des petites molécules. Selon leur volatilité et leur fragilité, on est amené à utiliser des méthodes d'ionisation différentes. La MS permet donc de déterminer le poids moléculaire d'une substance, et les diverses fragmentations renseignent sur sa structure.
Mais on a toujours rien sur la pureté, il faudrait utiliser d'autre techniques complémentaires. Pour preuve la MS fournit des éléments d'information sur la structure des oligosaccharides fixés sur les chaînes peptidiques. Il existe des méthodes chimiques simples de déglycosylation des protéines N- ou O-glycosylées, qui laissent intacts les résidus oligosaccharides. La MS permet d'obtenir la masse moléculaire des oligosaccharides, et l'analyse des fragmentations renseigne sur la nature des sucres présents. Il est toutefois nécessaire d'utiliser simultanément d'autres techniques complémentaires (clivages enzymatiques, RMN,…).
Source
http://www.cnrs.fr/Cnrspresse/n386/pdf/n386a01.pdf
https://cours.espci.fr/site.php?id=41&fileid=230
http://www-esbs.u-strasbg.fr/notesdecours/3eme-annee/gap/MmeSanglier05-10-05/Intro_SS.pdf
http://biologie.univ-mrs.fr/upload/p289/SpectroMasse_300413.pdf
Le couplage HPLC à un spectromètre de masse
Lorsque le détecteur montre un pic, une partie de ce qui se passe à travers le détecteur à ce moment peut être redirigés vers un spectromètre de masse. Là, il donnera un schéma de fragmentation, qui peut être comparée à une base de données de modèles connus. Cela signifie que l'identité d'une vaste gamme de composés peut être trouvée sans avoir à connaître leur temps de rétention.
même si comme max je ne les utilise pas lire se genre d'article est toujours enrichissant pour notre savoir
